1960年代，由于氣相色譜對高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上*臺液相色譜儀，開啟了液相色譜的時代。液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。

　　

　　1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著液相色譜法 (HPLC）正式建立。在此后的時間里，液相色譜成為zui為常用的分離和檢測手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。

　　

　　1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。

　　

　　液相色譜儀的技術(shù)特點(diǎn)

　　

　　高壓——壓力可達(dá)150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。

　　

　　高速——流速為0.1～10.0 mL/min。

　　

　　——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。

　　

　　高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。

　　

　　HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

　　

　　速度快——通常分析一個樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。

　　

　　分辨率高——可選擇固定相和流動相以達(dá)到*分離效果。

　　

　　靈敏度高——紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。

　　

　　色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

　　

　　樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。